A génszerkesztés több gén működését is felboríthatja – tartós epigenetikai változásokon keresztül

Egy új tanulmány szerint a CRISPR/Cas génszerkesztés hatásai messze túlmutathatnak a célzott módosításokon: a beavatkozás több gén működését is megzavarhatja, és ezek a változások tartósan fennmaradhatnak a sejtekben. A jelenség a DNS kettős szálának elvágása és annak hibajavítása során alakul ki.

A Science folyóiratban megjelent tanulmányt Claire Robinson és Dr. Michael Antoniou (a londoni King’s College Orvosi és Molekuláris Genetikai Tanszékének molekuláris genetika professzora) ismertették a GMWatch oldalán. Összefoglalójuk szerint a CRISPR/Cas génszerkesztés úgynevezett „kromatinfáradtságot” okozhat – egy újonnan azonosított mechanizmust, amely révén nem kívánt változások léphetnek fel a génműködésben.

 

A sejtek a DNS-üket egy háromdimenziós szerkezetbe (kromatinba) szervezik, amely kulcsszerepet játszik abban, hogy mely gének kapcsolódnak be vagy ki. Az új tanulmány szerzői – akik Dániában dolgoznak – azt vizsgálták, hogy a kromatin szerkezete teljes mértékben helyreáll-e a génszerkesztés során alkalmazott DNS-törés kijavítása után. A kutatók CRISPR/Cas génszerkesztést alkalmazva célzott DNS-töréseket idéztek elő (ez a génszerkesztési folyamat szükséges és általános első lépése), majd nyomon követték a genom (kromatin) szerveződésében és a génaktivitásban bekövetkező változásokat. Megállapították, hogy még a DNS kijavítása után is az érintett régiók kromatinja rendezetlen maradt, és több gén kifejeződése csökkent, ráadásul ezek a változások az utódsejtekben is fennmaradtak. A DNS-károsodás tehát tartós nyomot hagy a génkifejeződésben.

A szerzők, Susanne Bantele és munkatársai ezt a jelenséget „kromatinfáradtságnak” nevezik. Megállapításuk szerint a sejtek DNS-törésre és DNS-javításra adott válaszának egy eddig ismeretlen következményéről van szó, amely tartósan megváltoztathatja a génszerkesztett sejtek felépítését és működését. Ez nemcsak a látszólag „sikeresen” szerkesztett sejteket érintheti, hanem azok egymást követő utódsejtjeit is

Az ilyen típusú hatást, amely nem a DNS szekvenciáját változtatja meg, hanem a génkifejeződést – vagyis azt, ahogyan a genetikai információ hasznosul –, epigenetikai („a gének feletti”) hatásnak nevezzük.

A tanulmány következményei

A vizsgálatot emberi sejtekben végezték, és a szerzők kizárólag az emberi génterápia vagy kísérleti alkalmazások keretében használt génszerkesztéssel foglalkoznak. A feltárt hatások azonban nagy valószínűséggel növényekben és állatokban is előfordulhatnak. Ennek oka, hogy a növények és az állatok ugyanazokon az alapvető gén- és kromatinszerkezeti jellemzőkön, valamint a hozzájuk kapcsolódó génszabályozási folyamatokon osztoznak. A megállapítások súlyos következményekkel járnak e szervezetek biztonságossága és működése szempontjából – és így arra nézve is, hogyan kellene szabályozni őket. Például:

• Génszerkesztett növények esetében a génkifejeződési mintázatok megváltozása módosult biokémiához vezethet, beleértve új toxinok és allergének megjelenését, meglévő toxinok és allergének magasabb szintjét, vagy a tápérték megváltozását.

• Növényekben a génszerkesztés által okozott, nem szándékolt génkifejeződési változások a végső, forgalomba kerülő termékben is megjelenhetnek – sőt, generációkon át fennmaradhatnak, ha nem történik elegendő visszakeresztezés hagyományos növényekkel a nem kívánt változások kiszűrésére.

• Génszerkesztett állatok esetében a DNS-javítást követő génkifejeződési zavarok súlyos élettani következményeket válthatnak ki, például fejlődési rendellenességeket vagy daganatos megbetegedéseket.

• Növények és állatok esetében még akkor is, ha a génszerkesztés látszólag sikeres, az így létrejött szervezeteket részletes molekuláris profilvizsgálatoknak és élettani elemzéseknek kell alávetni, hogy feltárhatók legyenek a nem szándékolt és potenciálisan veszélyes következmények.

• Vizsgálni kell azt is, hogy a „kromatinfáradtságként” ismert epigenetikai jelenség stabilan öröklődik-e – nemcsak az egymást követő sejtosztódások során, hanem az egész szervezet további generációiban, szaporodás útján is.

A kutatók felfedezése a génszerkesztés minden típusára vonatkozik, legyen szó SDN1-ről (génkiütés), SDN2-ről (génmódosítás javító templát beillesztésével) vagy SDN3-ról (génbeillesztés). Ennek oka, hogy mindhárom eljárás a DNS kettős szálának elvágásával kezdődik, majd a sejt saját javító mechanizmusaira támaszkodik, hogy a két elszakadt DNS-véget úgy kapcsolja össze, hogy az tartalmazza a kívánt „szerkesztést”.

Az új eredmények meggyőző bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy a génszerkesztett szervezetek – vagy azok egyes kategóriáinak, például az SDN1 és SDN2 típusoknak – deregulációjára irányuló törekvések félrevezetőek és felelőtlenek.

A cikkhez csak lazábban kapcsolódó megfigyelésként a szerzők felvetik, hogy a sarlósejtes vérszegénység és a béta-thalassemia kezelésére jóváhagyott CRISPR/Cas-alapú génterápiában részesült betegeket érdemes lenne transzkriptomikai elemzéssel (azaz a génkifejeződés átfogó vizsgálatával) is megvizsgálni, annak feltárására, hogy a DNS kettősszál-törésének javítása és az ebből következő kromatinfáradtság okoz-e nem szándékolt változásokat a génkifejeződésben.

Mi az újdonság ebben a tanulmányban?

Korábbi bizonyítékok már kimutatták, hogy a génszerkesztés DNS-károsodást okozhat kisebb és nagyobb törlések, beillesztések és átrendeződések formájában – beleértve a kromotripszist, azaz a kromoszómák szétesését és kaotikus újraösszekapcsolódását is – a genomban mind a célzott, mind a nem célzott helyeken. Ezek a változások nem szándékolt génműködési zavarokhoz vezethetnek, amelyeknek egészségügyi és környezeti következményei is lehetnek.

Az új tanulmány ehhez egy újabb mechanizmust ad hozzá – a kromatinfáradtságot –, amely révén a génszerkesztési folyamatok súlyos génműködési zavarokat okozhatnak: a CRISPR által kiváltott DNS-kettősszál-törés és az azt követő javítás számos gén kifejeződését súlyosan károsíthatja.

Jobbá válhat-e a génszerkesztés, és kiküszöbölhető-e ez a kockázat?

A kromatinfáradtság által jelentett további kockázatok akkor is fennmaradnak, ha a génszerkesztési technológia odáig fejlődik, hogy a módosítás pontosan célzottan történik, és a génszerkesztő eszköz nem okoz nem célzott (off-target) mutációkat (bár ez az elképzelt állapot a géntechnológia „Szent Grálja”, amelynek megvalósulása erősen kétséges). Ennek oka, hogy a kromatinfáradtság célzott (on-target) hatás: a célzott szerkesztési hely körüli kromatintartományban alakul ki, a szándékolt A kromatinfáradtság által jelentett további kockázatok akkor is fennmaradnak, ha a génszerkesztési technológia odáig fejlődik, hogy a módosítás pontosan célzottan történik, és a génszerkesztő eszköz nem okoz céltévesztő mutációkat (bár ez az elképzelt állapot a géntechnológia „Szent Grálja”, amelynek megvalósulása erősen kétséges). Ennek oka, hogy a kromatinfáradtság nem céltévesztő hatás, hanem a célzott szerkesztési helyen vagy annak közvetlen környezetében jelentkező nem kívánt hatás: a célzott szerkesztési hely körüli kromatintartományban alakul ki, a szándékolt DNS-javítás elkerülhetetlen következményeként. Éppen ezért ez a kockázat „fejlettebb” génszerkesztési technikák alkalmazásával sem küszöbölhető ki.

Miért alakul ki ez a hatás?

A kromatin úgynevezett doménekbe szerveződik, amelyek mindegyike általában több gént foglal magában. Egy kromatindomén szerkezete a génkifejeződés szempontjából lehet megengedő vagy éppen gátló. Ezért egy adott gén vagy géncsoport működését alapvetően meghatározza az a kromatinkörnyezet, amelyben elhelyezkedik. Az új tanulmány azt mutatja, hogy a génszerkesztési folyamat során (a DNS kettősszál-törése és annak javítása közben) a beavatkozás nem csupán egy vagy néhány gén működését változtatja meg, hanem sok génét egyszerre: a célzott gén vagy gének környezetében lévő kromatindomén szerkezetének megzavarása miatt. Egyes gének aktiválódhatnak, míg mások kikapcsolódhatnak.

Ebben a folyamatban szertefoszlik a precizitás és az előrejelezhetőség ígérete. Még akkor is, ha a génszerkesztés során előidézett DNS-kettősszál-törés látszólag sikeresen helyreáll, a „szerkesztés” eredményei nem kiszámíthatók.

A természetben is előfordul mindez?

A szerzők a tanulmányukban megjegyzik, hogy a DNS kettősszál-törései környezeti hatások következtében is létrejöhetnek, nemcsak génszerkesztés során – ezt azonban nem támasztják alá, és azt sem részletezik, pontosan milyen hatásokra gondolnak. Közelebbről megvizsgálva kiderül, hogy azok a környezeti hatások, amelyek ilyen típusú DNS-károsodást okozhatnak, a természetben ritkán, ha egyáltalán előfordulnak, és inkább szélsőséges, akár katasztrofális helyzetekhez köthetők. Ilyenek például a mutagén vegyi anyagoknak való kitettség, illetve az ionizáló sugárzás (például röntgensugárzás, nukleáris balesetek, vagy radioaktív elemek, mint az urán). Bár radioaktív anyagok a természetben is jelen vannak, az ezeknek való kitettség általában alacsony, és szigorú védelmi szabályozás alá esik. Hasonló a helyzet a mutagén vegyi anyagokkal is.

A Nature Education egyik cikke ismerteti az ionizáló sugárzásnak való kitettség nyomán kialakuló mutációk (DNS-károsodások) lehetséges következményeit: „Ezek [a kettős szálú DNS-törések] rendkívül károsak. Amellett, hogy gátolhatják a transzkripciót vagy a replikációt, kromoszóma-átrendeződésekhez is vezethetnek, amelyek során az egyik kromoszóma darabjai egy másik kromoszómához kapcsolódnak. Ennek során gének sérülnek, ami hibrid fehérjék kialakulásához vagy gének nem megfelelő aktiválódásához vezethet. [Állatokban, köztük az emberben] több daganatos megbetegedés is összefüggésbe hozható az ilyen átrendeződésekkel.”

A Nature Education cikke ugyanakkor azt is megjegyzi, hogy az ilyen mutációk kedvező oldala az lehet, hogy hasznos genetikai változatosság forrásai lehetnek. Döntő fontosságú azonban, hogy – mint a szerző hozzáteszi – ezek a mutációk az evolúció során a szelekció hatása alá kerülnek: vagy fennmaradnak, vagy kiszelektálódnak. Ez védi az élő szervezeteket és a környezetet attól, hogy a káros tulajdonságok széles körben elterjedjenek.

Ez az a szempont, amelyet a GMWatch is hangsúlyoz a génszerkesztés során létrejövő nem kívánt idegen DNS-beépülések, illetve a természetben esetlegesen előforduló ilyen események összevetése kapcsán. A génszerkesztett szervezeteket ugyanis sokkal nagyobb léptékben és jóval rövidebb idő alatt bocsátanák ki a környezetbe, mint ahogyan egy természetes úton létrejövő, megváltozott génkifejeződésű mutáns elterjedne. Ezért a géntechnológiával létrehozott, majd tömegesen alkalmazott génszerkesztett szervezetek – a mezőgazdaságban és az ökoszisztémákban – nem részesülnek az „evolúciós idő” által nyújtott biztonsági szűrőben.

A mutagenezises nemesítésben alkalmazott mutagének nem tekinthetők természetes környezeti hatásoknak

A mutagenezises nemesítés során a növényeket szándékosan teszik ki mutagén vegyi anyagoknak vagy radioaktív sugárforrásoknak. Ez nem természetes folyamat: kifejezetten arra irányul, hogy nagyszámú mutációt idézzen elő, beleértve a DNS kettősszál-töréseit is. Az eredmény – ahogy azt bármely ezzel foglalkozó tankönyv is leírja – a torz, terméketlen vagy életképtelen növények tömeges megjelenése. Ha a nemesítő szerencsés, ezek közül esetleg egy-két véletlenszerű mutáció hasznosnak bizonyul, és további nemesítésre felhasználható.

A mutagenezises nemesítés ritka „sikertörténetei” közé tartozik például az árpa törpenövésű változata. Összességében azonban ez a módszer nem bizonyult különösebben hatékonynak hasznos növényi tulajdonságok előállításában. Ennek megfelelően az 1990-es évektől kezdve alkalmazása drasztikusan visszaszorult, mára pedig elhanyagolható szintre csökkent.

Röviden: jól dokumentált, hogy a mutagenezises nemesítésnek alávetett növényeknél szélsőséges rendellenességek tömegesen fordulnak elő. Ezzel szemben a hagyományos nemesítés és a természetes szaporodás során az ilyen mértékű eltérések ritkák. Ha ez nem így lenne, a növény- és állattenyésztők sem tudnák hatékonyan végezni a munkájukat.

Ezért nem feltételezhetjük, hogy a génszerkesztés során rutinszerűen előidézett DNS-kettősszál-törések és az ezek nyomán kialakuló kromatinfáradtság ugyanolyan módon létrejöhet a hagyományos nemesítés során, pusztán a szokásos környezeti hatások következtében. Ezt a következtetést tudományos eredmények is alátámasztják: a lektorált szakirodalom szerint a génszerkesztés 1000–10 000-szer erősebb mutagén hatással bír, mint a kémiai vagy sugárzásos mutagenezis, amelyek viszont nagyságrendekkel erősebbek, mint a természetes szaporodás során fellépő változások.

Mindezeket figyelembe véve egyértelműnek tűnik, hogy a DNS kettősszál-törései nyomán kialakuló kromatinfáradtság a hagyományos nemesítés során korántsem fordul elő olyan gyakorisággal, mint a génszerkesztés esetében – ha egyáltalán előfordul normál környezeti feltételek mellett. Ezért a kromatinfáradtság csupán a legújabb azon nem szándékolt hatások sorában, amelyek a génszerkesztett szervezetek kockázati profilját messze a hagyományos nemesítéssel előállított szervezetek fölé emelik.

Figyelmeztetés a dereguláció hívei számára

A tanulmány eredményei egyértelmű figyelmeztetésként szolgálnak mindazok számára – GMO-fejlesztők, politikai döntéshozók és szabályozó hatóságok –, akik úgy vélik, hogy az SDN1 típusú génszerkesztés mindössze egyetlen gén megváltoztatását jelenti. A valóságban azonban egyetlen gén „szerkesztése” is számos gén működésének megzavarásához vezethet, és ezek a hatások reálisan megjelenhetnek a végül forgalomba kerülő génszerkesztett növényekben vagy állatokban is.

Amikor a kritikusok erre rámutatnak, a gémódosított növényeket fejlesztő vállalatok gyakran azzal érvelnek, hogy a további nemesítéshez csak azokat a növényeket választják ki, amelyek a kívánt, kisebb génmódosításokat hordozzák. Az új eredmények azonban azt mutatják, hogy ezek a kívánt módosítások – bármilyen kicsik és bármilyen pontosan célzottak is – nagy léptékű, nem szándékolt kromatinzavarokkal járhatnak együtt, amelyek számos gén működését befolyásolják. Ráadásul ezek a nem kívánt hatások akár az utódgenerációkban is fennmaradhatnak – ennek lehetőségét további vizsgálatokkal kell tisztázni.

Az eredmények alapjaiban kérdőjelezik meg az Európai Bizottság azon javaslatát, amely szerint a génszerkesztett növényeket mentesíteni lehetne a kockázatértékelés és a jelölés alól, ha kevesebb mint 20 genetikai módosításban térnek el a kiinduló növénytől. Még ha a szándékolt változtatások száma kevesebb is 20-nál, a génkifejeződésben bekövetkező változások kiterjedtek lehetnek, és potenciálisan kockázatot jelenthetnek.

A tanulmány továbbá újabb súlyos kérdéseket vet fel az Egyesült Királyság úgynevezett „precíziós nemesítés jogszabályával” kapcsolatban is, amely kivenné az engedélyezési körből azokat a génszerkesztett növényeket és állatokat, amelyek elméletileg „hagyományos folyamatokkal” – vagyis konvencionális nemesítéssel – is létrejöhetnének. Ahogyan fentebb is láttuk, még ha a kromatinfáradtság a természetben elő is fordulna, annak hatásai az evolúciós szelekció során kiszűrődnek vagy fennmaradnak. Ez a „precíziós nemesítés” keretében létrehozott GMO-k esetében nem érvényesül.

Furcamód az új tanulmány több szerzője a Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research munkatársa. A génmódosítás orvosi alkalmazásaira összpontosító Novo Nordisk vállalat és a Novo Nordisk Alapítvány a „Novo-család” nevű csoport részei, amely aktívan lobbizik a GMO-k deregulációjáért. Azt javasoljuk, hogy a lobbisták olvassák el, és vegyék komolyan saját kutatóik új eredményeit.

Ha nem keresed, nem találod meg

Ha egy génszerkesztett növény elfogadhatónak tűnik, és – ahogy ez általában történik – a fejlesztő nem végzi el azokat a mélyreható vizsgálatokat, amelyek feltárhatnák a génkifejeződés zavarait, akkor a rejtett problémák észrevétlenek maradhatnak – például azok, amelyek a növény élelmiszerbiztonsági vagy környezeti hatásait érintik. Ezek a problémák így a végül forgalomba kerülő termékben is jelen maradhatnak.

Ha mégis észlelnek problémákat, megpróbálhatják azokat egymást követő visszakeresztezésekkel eltávolítani hagyományos növényekkel. Ez az eljárás azonban költséges, időigényes és számos nehézséggel jár, mivel fennáll a veszélye annak is, hogy a kívánt tulajdonságok is elvesznek. Ennek következtében a „genomtisztítás” visszakeresztezéssel általában nem történik meg kellő alapossággal.

Mi lenne a következő lépés?

A tanulmány tovább erősíti annak szükségességét – amelyet a GMWatch és számos tudós már régóta hangsúlyoz –, hogy minden génszerkesztett szervezet esetében a forgalomba hozatal előtt több omikai szintet átfogó, részletes molekuláris vizsgálatokat (multi-omikai elemzéseket) végezzenek. Az eredményeket a kockázatértékelés részeként a szabályozó hatóságok számára is be kell nyújtani.

A transzkriptomikai vizsgálatok feltárhatják a génszerkesztés következtében kialakuló, nem várt génkifejeződési változásokat; a proteomikai elemzések a fehérjeösszetétel változásait mutatják meg; míg a metabolomikai vizsgálatok az anyagcsere (biokémiai folyamatok) módosulásait tárják fel. Ez utóbbi két módszer különösen fontos annak kimutatására, hogy keletkeztek-e új toxinok vagy allergének, illetve megváltozott-e a meglévő toxikus vagy allergén anyagok szintje a génszerkesztés következtében.

Az, hogy a legtöbb GMO-fejlesztő nem végzi el ezeket a vizsgálatokat – sőt, sokszor vonakodik is tőlük –, és hogy a szabályozó hatóságok sem követelik meg azokat, magyarázatot adhat arra, miért jellemzi az új génszerkesztett GMO-k eddigi történetét az, hogy a laboratóriumok és üvegházak ellenőrzött körülményei között még ígéretesnek tűnnek, később azonban kudarcot vallanak a szántóföldön és a piacon. A génszerkesztett termékek fejlesztői saját kárukra hagyják figyelmen kívül azokat a tudományos eredményeket, amelyek a nem szándékolt, nagyléptékű genetikai károsodások és a génműködés megváltozott mintázatainak egyre bővülő körét tárják fel. Ezek ugyanis nemcsak a növények és állatok teljesítményét ronthatják, hanem az egészséget és a környezetet is veszélyeztethetik.

Az itt ismertetett tanulmány:

Bantele S et al (2025). Repair of DNA double-strand breaks leaves heritable impairment to genome function. Science 390(6773). DOI: 10.1126/science.adk6662 https://www.science.org/doi/abs/10.1126/science.adk6662

A Science oldalán elérhető változat fizetős, de a preprint változat itt olvasható:
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.08.29.555258v2

(Ezt a blogbejegyzést a Fenntarthatóság Felé Egyesület készítette az Agrárminisztérium támogatásával.)

A GMO 2.0 során használt „génollók” kaotikus zavart okoznak a növények genomjában

Miközben az EU döntéshozói azon ügyködnek, hogy kivonják az uniós GMO-szabályozás hatálya alól a génmódosított növények új generációját – nem lenne hatásvizsgálat, engedélyezni, sőt jelölni sem kéne az új GMO-kat –, egyre több kutatás támasztja alá azt, hogy ezek a technológiák egyáltalán nem olyan precízek illetve biztonságosak, mint azt a pártolói állítják. A Testbiotech egyik összefoglalója például arra hívja fel a figyelmet, hogy egy nemzetközi kutató csoport arról számolt be, hogy kromotripszist (destruktív kromoszóma-átrendeződést) figyeltek meg CRISPR/Cas technológiával előállított génmódosított paradicsomokban.

Nem tervezetett, destruktív kromoszóma-átrendeződés a „génszerkesztett” növényekben

A kromotripszisről már a géntechnolgiai óriáscégektől független kutatók hálózata, az ENSSER 2023. januári CRISPR-állásfoglalásában is olvashattunk, ekkor még csak az új génmódosítási technikákkal előállított emlős (és emberi) sejtekben figyeltek meg kromotripszist:

Az a tény, hogy a CRISPR/Cas eljárásban a "szerkesztés" célzottan a genom adott szekvenciájára irányítható, adta az alapját annak az állításnak, hogy a módszer pontos és előrejelezhető eredményeket szolgáltat. A szerkesztés azonban csak azután következik be, hogy a CRISPR/Cas végrehajtotta funkcióját, amelynek a célja a legtöbb esetben az, hogy kettős szálú DNS-szakadást hozzon létre. Maga a szerkesztés az ezt követő DNS-javítási folyamatok aktiválódásából ered, s e folyamatok során gyakran fordulnak elő hibák. Így a szerkesztés eredménye sem nem precíz, sem nem áll teljes mértékben a génmérnök irányítása alatt, hiszen a sejt saját DNS-javítási folyamatainak alakulásaitól függ.

Ennek következtében nemcsak a tervezett genetikai módosítás jöhet létre a CRISPR/Cas génszerkesztési folyamatban, hanem az nem kívánt mutációkat (DNS-károsodást) is eredményezhet, akár a tervezett szerkesztési helyen ("célzott"), akár a genom más területein ("céltévesztő"). Ezek a nem tervezett mutációk magukban foglalhatják nagy DNS-szakaszok törlését, beszúrását vagy átrendeződését, mutáns fehérjék termelődését eredményező, új génszekvenciák létrehozását, nem tervezett módosításokat a genomnak a célzott helyhez hasonló részein, de kromoszóma-átrendeződés is felléphet (kromotripszis – olyan destruktív genomátrendeződés, amelyben széttöredezett kromoszómadarabok újrarendeződése véletlenszerűen következik be), ami komoly biztonsági aggályokat vet fel.

A génszerkesztett növények esetében (akár a CRISPR/Cas, akár más új genetikai módosítási módszerekkel készültek), a génszerkesztési folyamat egésze (szövettenyésztés, sejttranszformáció, a génszerkesztési eljárás célzott vagy céltévesztő kimenetelei) szükségszerűen eredményez nem kívánt módosult génfunkció-mintázatokat. Ezek pedig változásokat idézhetnek elő a növény biokémiai folyamataiban oly módon, hogy az váratlanul új toxinokat vagy allergéneket termeljen, ismert toxinjait vagy allergénjeit megváltozott szinteken termelje, avagy tápértéke változzon. Ezek a változások negatív hatással lehetnek az ezen növényeket fogyasztó emberi vagy állati szervezetek egészségi állapotára, valamint a tágabb ökoszisztémára is, amint arra bizonyos kutatók felhívták a figyelmet.

Néhány hónappal később hívta fel a figyelmet a Testbiotech, hogy egy nemzetközi kutató csoport arról számolt be, hogy kromotripszist figyeltek meg egy CRISPR/Cas technológiával előállított génmódosított paradicsomokban is.

A „génollók” kaotikus zavart okoznak a növények genomjában

Első alkalommal mutatták ki a kromotripszist növényekben CRISPR/Cas alkalmazását követően

Rövid összefoglaló:

A legújabb publikációk szerint a „génollók” növényekben történő alkalmazása a korábban feltételezettnél jóval nagyobb kockázattal jár a genom mélyreható károsodása szempontjából. A genom kiterjedt területei is érintettek lehetnek.

Ebben az összefüggésben a kromotripszishez hasonló hatások meghatározó szerepet játszanak. A kromotripszis olyan jelenség, amely során egyetlen „katasztrofikus” eseményben több száz genetikai változás következhet be egyidejűleg. Ilyenkor a genetikai állomány számos szakasza felcserélődhet, megcsavarodhat, újrakombinálódhat, vagy akár el is veszhet. Korábban már ismert volt, hogy ilyen hatásokat kiválthat a CRISPR/Cas „génolló” alkalmazása emlős (és emberi) sejtekben. Most pedig első alkalommal növényekben is kimutatták a kromotripszishez hasonló hatásokat a CRISPR/Cas génolló alkalmazását követően.

A kromotripszis pontos mechanizmusai még nem teljesen ismertek. Az azonban ismert, hogy a genetikai állomány mindkét szálának egyidejű megszakadása kiválthatja ezeket a kaotikus hatásokat. Amikor a DNS mindkét szálát elvágják – ahogyan az a CRISPR/Cas „génolló” alkalmazása során jellemzően történik –, a kromoszómák elveszítik a kapcsolatot a folyamat során szétválasztott végekkel. Ha a kromoszómák törésének kijavítása nem sikerül megfelelően, a levált vég elveszhet, vagy átrendeződhet, és akár máshol be is épülhet.

A „génollók” alkalmazása jelentősen növeli a kromotripszis előfordulásának gyakoriságát. Emellett megnő annak a valószínűsége is, hogy a genomban bizonyos, egyébként védett területek is érintetté válnak. A lehetséges nem kívánt következmények széles körű kockázatokat foglalnak magukban, többek között a növény egészségi állapotának romlását, a környezettel való kölcsönhatásainak megváltozását, valamint a növény összetételének nem kívánt módosulását.

A Samach és munkatársai által közzétett eredmények új megvilágításba helyezik a génollók állítólagos precizitását: az új génmódosítási technikák lehetővé teszik, hogy a genomban meghatározott helyeket célozzanak meg, például génfunkciók kiiktatása céljából. Ugyanakkor ezeknek a „vágásoknak” a következményei nem előre jelezhetők, és nem is kontrollálhatók. A nem szándékolt genetikai változások a kromoszómák nagy szakaszait is érinthetik. Az új génmódosítási technikákkal előállított növények ezért nem tekinthetők eleve „biztonságosnak”, és a kockázatokat alaposan vizsgálni kell.

A „génollók” alkalmazása növeli a kromotripszis bekövetkezésének valószínűségét

Ha mutációk lépnek fel, a sejtek megpróbálják kijavítani a hibát, és sok esetben képesek helyreállítani az eredeti működést. Mivel a fontos génfunkciók gyakran különösen jól védettek a funkcióvesztéssel szemben, a mutációk nem azonos gyakorisággal fordulnak elő a genom minden pontján (Monroe et al., 2022).

Az új génmódosítási technikák azonban eltérnek ezektől a természetes folyamatoktól: a CRISPR/Cas nukleáz (azaz a „génolló”) alkalmazása rendszerint a genetikai állomány mindkét szálának elvágását okozza. Ha a sejtek megpróbálják helyreállítani az eredeti génfunkciót, a nukleáz felismerheti a már kijavított célterületet, és újra elvághatja azt, ezzel megzavarva a javítási folyamatokat. Különösen növények esetében az érintett gének gyakran több példányban vannak jelen, ezért a „génollók” alkalmazása tipikusan több kettős szálú DNS-törést idéz elő a genomban, ráadásul egy meghatározott mintázatban (lásd pl. Sanchez-Leon, 2018). A „génollók” emellett lehetővé teszik olyan genetikai helyek módosítását is, amelyek egyébként különösen jól védettek a funkcióvesztéssel szemben (Kawall, 2019).

Korábban már ismert volt, hogy a „génollók” alkalmazása jelentősen növeli a kromotripszis bekövetkezésének valószínűségét emlős- (és emberi) sejtekben (Ledford, 2020; Leibowitz et al., 2021; Amendola et al., 2022). Ennek következtében a CRISPR/Cas9 klinikai alkalmazása kapcsán komoly biztonsági aggályok merültek fel a katasztrofális DNS-átrendeződések miatt, amelyeket olykor már „CRISPRtripszisként” is emlegetnek (Amendola et al., 2022). Most pedig első alkalommal növényekben is kimutatták ezeket a hatásokat a CRISPR/Cas alkalmazását követően. Ezt megelőzően növényekben már más génmódosítási eljárásokkal összefüggésben is észleltek kromotripszist (Chu & Agapito-Tenfen, 2022).

A kromotripszis mechanizmusai

Egy friss publikáció szerint (de Groot et al., 2023) a kettős szálú DNS-törések a kromotripszis kiváltó tényezői lehetnek. Bár a folyamat minden részlete még nem teljesen ismert, az nem kérdéses, hogy különösen a CRISPR/Cas nukleáz alkalmazása jelentősen növelheti ezen hatások bekövetkezésének valószínűségét.

Feltételezhető, hogy a megzavart DNS-javítási folyamatok kulcsszerepet játszanak (de Groot et al., 2023): ha a sejtek nem tudják azonnal újraegyesíteni a DNS szétvált végeit, a kromoszómáról levált genomszakaszok végpontjain különböző folyamatok indulhatnak el. Ezek a folyamatok a levált kromoszómaszegmensek nagy részét érinthetik, és jelentős mértékű káoszt okozhatnak. A genetikai állomány egyes szakaszai megcsavarodva épülhetnek vissza, megkettőződhetnek, vagy akár teljesen el is veszhetnek. Bizonyos esetekben a feldarabolódott kromoszómák DNS-végei e változások ellenére újra összekapcsolódhatnak egymással; más esetekben viszont a kromoszóma más szakaszaival létesítenek új kapcsolatokat, ami a genetikai állomány szerkezetének jelentős átalakulásához vezethet (de Groot et al., 2023). A kromoszómák nagyobb szakaszai akár teljesen el is veszhetnek.

Ábra: Példák a kromotripszis által okozott hatásokra: a kromoszómáról levált genomszakaszok végpontjain különböző folyamatok indulhatnak el. A genetikai állomány egyes szakaszai megcsavarodva épülhetnek vissza, megkettőződhetnek, vagy akár teljesen el is veszhetnek (de Groot et al., 2023 alapján átdolgozva - Testbiotech).

Ezek a folyamatok többek között különféle típusú rákos megbetegedéseket válthatnak ki emlősökben (és emberekben) (Leibowitz et al., 2021; Amendola et al., 2022). Növényekben a génaktivitás megváltozhat, az anyagcsere-folyamatok és a növekedés zavart szenvedhet, illetve új alkotóelemek is termelődhetnek a növényekben. Mindez negatív következményekkel járhat az egészségre és a környezetre, valamint a növények kórokozókkal és klímastresszel szembeni ellenálló képességére is. A kockázatok általában nem becsülhetők meg előre, ezért minden esetben egyedileg kell vizsgálni őket.

Első megfigyelések növényekben

Egy friss tanulmány (Samach et al., 2023) paradicsomon végzett kísérleteket ír le. Annak érdekében, hogy a CRISPR/Cas alkalmazását követően azonosítani tudják a kromotripszist, a kutatók először olyan további géneket juttattak be, amelyek könnyen felismerhető színt eredményeznek.

Ezekben a növényekben a „génollókat” arra használták, hogy a mesterséges markergéneket hordozó DNS-szakaszt elválasszák a kromoszóma többi részétől. A kutatók azt várták volna, hogy a sejtek úgy javítják ki ezt a vágást, hogy csak ez az egy hely módosul. A vágás előtti és utáni génszakaszoknak változatlanoknak kellett volna maradniuk.

Néhány növény esetében azonban a szín intenzitása később megváltozott, ami arra utalt, hogy a génollók alkalmazása korántsem csak a célzott régiót érintette: a marker vagy eltűnt, vagy néhány esetben még intenzívebb színt eredményezett. Ezeknek a növényeknek a genetikai állományát ezt követően részletesebben is megvizsgálták. Ez a vizsgálat a nem szándékolt hatások széles skáláját tárta fel:

• Néhány esetben a mesterséges génmarkert a DNS mindkét szálán megtalálták, vagyis a DNS megszakadását követően az érintett génszakasz megkettőződött (a tulajdonság szomatikus crossing-over révén homozigóttá vált). Az így létrejött paradicsomok virágainak és terméseinek színe erőteljesen megváltozott.

• Több esetben a színezék elveszett, mert az adott kromoszómaszegmenst kromotripszis érintette. Ezekben az esetekben a teljes kromoszóma elvesztését, illetve nagymértékű DNS-átrendeződéseket, a genetikai állomány jelentős részeinek elvesztését, valamint génszakaszok új kombinációinak kialakulását figyelték meg.

A kutatók (Samach et al., 2023) arra a következtetésre jutottak, hogy a génollók alkalmazása olyan „katasztrofikus esemény” volt, amely kiváltotta a kromotripszis folyamatát. Eddig ez a hatás növényekben nem volt ismert a „génollók” alkalmazásával összefüggésben, valószínűleg azért, mert korábban senki nem végzett ehhez hasonló vizsgálatokat. Valójában a kromotripszis hatásait nem mindig könnyű kimutatni: ha egy célzott génfunkció a génollók alkalmazása után megszűnik, azt okozhatja a genomban végrehajtott szándékolt vágás is, de kromotripszishez hasonló változások is állhatnak mögötte, amelyek a genom jóval nagyobb részeit érintik.

A kísérleti eredményeket megfelelő súllyal kell figyelembe venni az új génmódosítási technikák növényekben való alkalmazásának szabályozásáról szóló további viták során.

Jelentősége az új génmódosítási technikákkal előállított növények szabályozása szempontjából

Emlős- (és emberi) sejtek esetében a génollók alkalmazása által kiváltott „CRISPRtripszis” hatásait már több éve intenzíven kutatják, mivel ezek – többek között – fejlődési rendellenességekhez és daganatos megbetegedésekhez vezethetnek (lásd: Leibowitz et al., 2021; Amendola et al., 2022).

Ezzel szemben növényekben ezt a jelenséget csak most mutatták ki a CRISPR/Cas génolló alkalmazásával összefüggésben (Samach et al., 2023). Megállapították, hogy a CRISPR/Cas alkalmazása a növények anyagcseréjének jelentős megváltozásához vezethet, ami kedvezőtlen hatásokkal járhat az egészségre és a környezetre, valamint veszélyeztetheti a növénynemesítés jövőjét is.

Az eredmények a szabályozás fokozott szükségességére hívják fel a figyelmet: bár a DNS-töréseket más tényezők – például nagy dózisú radioaktív sugárzás – is kiválthatják, kérdéses, hogy ezek a változások ugyanazon a helyeken és ugyanolyan gyakorisággal következnek-e be, és ezáltal hasonló hatásokat eredményeznek-e.

Általánosságban feltételezhető, hogy a genetikai sokféleség növelése érdekében alkalmazott fizikai és kémiai módszerekkel kiváltott, nem célzott genetikai változások nem idéznek elő olyan eseményeket, amelyek természetes úton ne fordulhatnának elő (lásd pl. EFSA, 2021).

Más a helyzet az új génmódosítási technikák esetében: jól ismert, hogy a biotechnológiai mutagének (például a génollók) által kiváltott genetikai változások és az ezekből kialakuló mintázatok jelentősen eltérhetnek a „véletlenszerű” folyamatoktól várható változásoktól (áttekintés: Koller et al., 2023). Ezek a hatások elkerülhetetlenül befolyásolják, hogy a kromotripszis hol és milyen gyakran fordul elő a genomban. Emellett nem zárható ki, hogy a génollók és a sejten belüli DNS-javító folyamatok kölcsönhatásai elősegítik vagy felerősítik a kromotripszis kialakulását és lefolyását.

Több érintett szereplő abból indul ki, hogy a génollók használata felgyorsítja a nemesítést, mivel ezek az eszközök precízek. Most azonban ismét világossá vált, hogy a génollók alkalmazásának e gyakran hangoztatott előnyei ilyen formában nem valósulnak meg: a CRISPR/Cas számos, kiterjedt és váratlan genetikai változást idézhet elő, amelyeket részletesen meg kell vizsgálni nemcsak a biztonság, hanem a további nemesítésre gyakorolt következmények szempontjából is.

Eddig úgy tűnik, hogy az Európai Bizottság abból indul ki: elegendő lenne, ha az új génmódosítási technikákkal előállított növények kockázatértékelése csak a szándékolt genetikai változásokra terjedne ki (lásd például: Testbiotech, 2023). Ebben az esetben azonban a kromotripszis hatásai sokszor rejtve maradnának. A következmények és a hosszú távú hatások számos tényezőtől függnek, például az adott génkombinációktól és a környezeti hatásoktól. Ezek a változások idővel észrevétlenül felhalmozódhatnak a nemesítési állományokban, és veszélyeztethetik a jövőbeli növénynemesítést, valamint az élelmezésbiztonságot is.

Hivatkozások:
Amendola M., Brusson M., Miccio A. (2022) CRISPRthripsis: the risk of CRISPR/Cas9-induced chromothripsis in gene therapy. Stem Cells Transl Med, 11_ 1003-1009.
https://doi.org/10.1093/stcltm/szac064

Chu, P. & Agapito-Tenfen, S.Z. (2022) Unintended Genomic Outcomes in Current and Next Generation GM Techniques: A Systematic Review. Plants, 11, 2997.
https://doi.org/10.3390/plants11212997

de Groot, D., Spanjaard, A., Hogenbirk, M.A., Jacobs, H. (2023) Chromosomal rearrangements and chromothripsis: the alternative end generation model. Int J Mol Sci, 24, 794.
https://doi.org/10.3390/ijms24010794

EFSA GMO Panel (2021) In vivo and in vitro random mutagenesis techniques in plants. EFSA J, 19(11): 6611. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2021.6611

Kawall K. (2019) New possibilities on the horizon: genome editing makes the whole genome accessible for changes. Front Plant Sci, 10: 525. https://doi.org/10.3389/fpls.2019.00525

Koller F., Schulz M., Juhas M., Bauer-Panskus A., Then C. (2023) The need for assessment of risks arising from interactions between NGT organisms from an EU perspective,. Environ Sci Eur, 35(1): 27. https://doi.org/10.1186/s12302-023-00734-3

Ledford, H. (2020), CRISPR Gene Editing in Human Embryos Wreaks Chromosome Mayhem, Nature 583, 17-18, https://www.nature.com/articles/d41586-020-01906-4

Leibowitz M.L., Papathanasiou S., Doerfler P.A., Blaine L.J., Sun L., Yao Y., Zhang C.-Z., Weiss M.J., Pellman D. (2021) Chromothripsis as an on-target consequence of CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Genet, 53(6): 895-905. https://doi.org/10.1038/s41588-021-00838-7

Monroe G., Srikant T., Carbonell-Bejerano P., Becker C., Lensink M., Exposito-Alonso M., Klein M., Hildebrandt J., Neumann N., Kliebenstein D., Weng M.-L., Imbert E., Ågren J., Rutter M.T., Fenster C.B., Weigel D. (2022) Mutation bias reflects natural selection in Arabidopsis thaliana. Nature, 602: 101-105. https://doi.org/10.1038/s41586-021-04269-6

Samach A., Mafessoni F., Gross O., Melamed-Bessudo C., Filler-Hayut S., Dahan-Meir T., Amsellem Z., Pawlowski W.P., Levy A.A. (2023) A CRISPR-induced DNA break can trigger crossover, chromosomal loss and chromothripsis-like rearrangements. BioRxiv. https://doi.org/10.1101/2023.05.22.541757

Sanchez-Leon S., Gil-Humanes J., Ozuna C.V., Gimenez M.J., Sousa C., Voytas D.F., Barro F. (2018) Low-gluten, nontransgenic wheat engineered with CRISPR/Cas9. Plant Biotechnol J, 16: 902-910. https://doi.org/10.1111/pbi.12837

Testbiotech (2023) The mandate of EFSA and unintended genetic changes caused by NGTs, letter to the EU Commission, https://www.testbiotech.org/sites/default/files/Lette%20Testbiotech_Commission_May%202023.pdf

(Ezt a blogbejegyzést a Fenntarthatóság Felé Egyesület készítette az Agrárminisztérium támogatásával.)